Anschließend assistierte er dem Priester von Pietrelcina und wurde im No­vem­ber 1915 zum Militärdienst als Sanitäter einberufen. Wegen seiner schlech­ten Gesundheit war der Dienst oft durch Genesungsurlaube un­ter­brochen, am 6. März 1918 wurde er für untauglich erklärt. Nach Aufenthalten in verschiedenen Klöstern kam er 1916 ins Kapuzinerkloster San Giovanni Rotondo, in dem er bis zu seinem Tod lebte.

Am Morgen des 20. Sep­tember 1918, einem Frei­tag, erlebte er das Leiden Christi so in­tensiv, dass auf seinem Körper plötzlich die fünf Wundmale Christi er­schienen, die ihn zum ers­ten stigmatisierten Priester in der Ge­schich­te der ka­tho­lischen Kirche machten, und die bis zu seinem Tod sichtbar blieben. Die Stig­mata führten zu wie­der­hol­ten, kirch­lich angeordneten medizinischen Untersu­chun­gen. Um die Wunden an den Händen zu verbergen, trug Pater Pio meist fin­ger­lo­se Handschuhe. Trotz gro­ßer, auch kirchlicher Zwei­fel an deren Echtheit, reis­ten zunehmend Pilger nach San Giovanni Rotondo zu den Gottesdiensten Pater Pios und suchten ihn als Beichtvater auf. Bald wurde Pater Pio wie ein Heiliger verehrt, und die Pilger spürten dies auch bei seinen Gottesdiensten, bei denen er der Wirklichkeit entrückt schien. Pater Pio wurden vom Volks­mund viele Fähigkeiten nachgesagt. So soll er wundersame Heilungen vollbracht haben, und seine prophetische Gabe ist legendär. So wird ihm nachgesagt, dem jun­gen Priester Karol Wojtyla 1947 sowohl die Wahl zum Oberhaupt der katho­li­schen Kirche als auch das Attentat von 1981 vorausgesagt zu haben.

Trotz der großen Menschenmassen, die ihn besuchten, verrichtete er seine Arbeit als Priester. Er galt als "Apostel des Beichtstuhls" und half vielen, ihren Glauben an Gott wiederzufinden.
Am 9. Januar 1940 begann er damit, Leiden der Pilger durch Handauflegen oder mit Worten zu lindern oder gar zu heilen. Diese Arbeit verrichtete er mit Hilfe von Anhängern und Spenden aus der ganzen Welt. In den Armen, Lei­denden und Kranken sah er das Bild Christi, besonders ihnen galt sein Werk der Nächstenliebe.
Im selben Jahr begann Pater Pio, Spenden für ein Krankenhaus zu sammeln. 1956 wurde die Casa Sollievo della Sofferenza (Haus der Linderung des Lei­dens) in San Giovanni Rotondo eröffnet, die damals zu den größten und mo­dernsten Kliniken Süd­italiens zählte. Pio nannte es "die Pupille seines Auges".

Im Sommer 2004 wurde nach mehrjähriger Bauzeit in San Giovanni Rotondo die neue Großkirche des Architekten Renzo Piano neben dem Grab des Paters eingeweiht. Damit hat Renzo Piano aus dem katholischen Wall­fahrtsort auch noch ein Pilgerziel für Architekturliebhaber aus der ganzen Welt gemacht.

Das Krankenhaus von San Giovanni Rotondo gilt als eines der besten im Lan­de. 1956 gab es 350 Betten, heute sind es weit über 1000. Die Arbeits­lo­sig­keit des Ortes beträgt nur ein Zehntel jener Apuliens. Es gibt ein Pater-Pio-Wachsfigurenkabinett, ein Pater-Pio-Museum, ein neues Kongresszentrum, ein Pater-Pio-Radio- und ein seit 2003 existierenden Pater-Pio-TV-Sender.

100 Mio Euro: die jährliche Bilanz des Pater-Pio-Businesses.

Es ist nicht lange her, da sorgte das Buch des Historikers Sergio Luzzatto, "Pater Pio - Wunder der Politik im Italien des 20. Jahrhunderts", für Auf­re­gung.
Laut diesem könnten die Wunden Pater Pios auf den Einsatz von Karbolsäure zurückzuführen sein, also ohne übernatürliche Ursache erklärbar sein.
Luzzatto fand nämlich Apothekenbestellungen Pios, nach denen dieser in grö­ßeren Mengen ätzende Säure orderte. Laut den Padre-Pio-Verteidigern sollte diese zur Desinfektion der Kranken und Anästhesiespritzen dienen.
Padre Pio also ein heiliger Scharlatan?